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0:02 obrigada matilda 0:03 e obrigado dr graviol 0:07 professor jackson você gosta de falar 0:09 alguma coisa 0:10 neste momento não tenho nada a acrescentar 0:14 exceto se houvesse alguma pergunta que eu 0:15 pode responder de outra forma 0:17 obrigado por organizar esta sessão 0:23 obrigado pergunta 0:27 por favor, está escrevendo inglês 0:32 você pode ler o comentário primeiro 0:34 1 0:37 você pode ler os comentários sim, mas eu 0:39 acho que a maioria deles 0:40 em português 0:44 não, eu pedi para você escrever em inglês i 0:46 tenho 0:47 nos comentários oh ok eu estava olhando 0:50 conversa privada 0:58 eu estou subindo na lista oh boy muito 1:00 Comente 1:04 você está nos comentários ainda sim, eu sou apenas 1:06 olhando os comentários muito rapidamente 1:09 uh crescer 1:12 anacrestia é é é a probabilidade 1:16 que o teste próspero dará falso 1:19 resultados negativos que é um 1:21 pergunta principalmente para gabriella gabriel 1:24 você pode responder isso 1:27 uh, então, no momento, não fazemos inteiramente 1:30 saber com meu teste 1:32 generally um 1:35 testes semelhantes a este têm um 1:37 sensibilidade de cerca de 1:39 90, então a probabilidade de dar um 1:42 resultado negativo é muito baixo 1:44 porque também tende a ter 1:45 sensibilidade de cerca de 1:47 80 a 90 também, então no geral é melhor 1:51 do que algumas das alternativas que existem 1:52 que não são rtq bcr ok outro 1:55 pergunta para você 1:57 também é de anna christina faz o 2:00 teste mais nítido 2:01 aplicar a outras doenças como o ebola 2:05 zika ou dank 2:08 então, na verdade, pretendemos adaptar o teste 2:11 para ebola 2:12 assim que pudermos, estamos brincando com 2:15 a ideia de fazer zika 2:16 leps e alguns outros porque todos nós 2:19 precisa fazer é mudar alguns dos 2:20 sequências que estamos usando 2:22 então os primers da lâmpada e o guia para 2:24 a 2:25 crisper cast 13 protein e nesse 2:28 ponto, poderemos começar imediatamente 2:30 detectar esses vírus também 2:32 então agora o teste existe é apenas um 2:34 questão de otimizá-lo para cada 2:35 vírus individual ok, há outro 2:39 pergunta da frança 2:40 nouvelle antártica quais são os 2:43 perspectiva de usar o castline crispr 2:46 tecnologia 2:47 para tratar o hiv devo admitir que não sou 2:51 um especialista em hiv eu sei que alguns grupos 2:54 estão trabalhando nisso 2:56 eu não sei qual é a chance de que 2:58 independente da resposta 2:59 isso vai funcionar, mas eu acho que isso é 3:02 muito zonal você conhece as bactérias 3:04 tem usado o cátion crispr 3:06 tecnologia há milhões de anos 3:08 cortar o vírus e então a ideia aqui é 3:12 para usar a tecnologia em cascata 3:14 atravessar para cortar o vírus hiv 3:17 eu acho que isso é bastante relacionável na verdade 3:19 no início do cobia 19 3:21 pandemia vi um grupo nos unidos 3:25 estados 3:25 que estavam propondo usar o crispr 3:29 tecnologia de elenco 9 3:31 de fato, para cortar o vírus da cópia 19 para 3:34 é a mesma abordagem para o hiv i 3:37 acho que isso é um 3:38 abordagem razoável meu laboratório não é 3:40 trabalhando nessa abordagem 3:46 também da convenção uh isso pode 3:49 substituto da tecnologia para ser antibiótico 3:52 num futuro próximo, por exemplo, para tratar 3:55 tuberculose multirresistente 3:59 novamente eu acho que é uma boa sugestão e 4:01 sim, de fato 4:03 o principal problema com o com estes 4:05 tecnologia crispr cas9 4:08 é encontrar uma técnica adequada para 4:10 entregar 4:11 ou a proteína fundida 9 o ferro fundido 4:13 gene 4:14 e até agora na terapia genética o que está sendo 4:18 usado é o vírus adeno associado 4:21 infelizmente eu não sabia associado 4:23 fortuna de creme de vírus para produzir 4:26 em uma prática de fabricação, então temos 4:29 para encontrar outro 4:30 método de entrega para entregar no cas9 4:33 proteína ou o gene cas9 4:35 e então facilitaria usá-lo porque 4:38 agora seria 4:39 muito caro para ser usado em vez de 4:42 a 4:42 antibiótico 4:46 também de fred sintético 4:49 crispr cast 9 pode ser uma opção no 4:52 futuro próximo 4:53 tratar kobe 4:58 Bem, tudo isso eu acho viável 5:01 se eu tivesse mais dinheiro no meu laboratório nós 5:04 poderia começar a trabalhar nisso 5:05 também acho que estes são um razoável 5:08 projeto 5:10 muitos dos comentários estão em português 5:12 infelizmente 5:17 não há nenhuma pergunta para isso apenas 5:20 comentários 5:21 deixe-me 5:34 sim eu vejo que eu vario entre dois e 5:38 cinco estrelas 5:43 bem uma pergunta do vitor é uh 5:47 gostaria de saber se é gostaria de saber se 5:50 crocante 5:51 é acessível ao sistema público de saúde 5:54 e se pode contribuir para o custo 5:56 redução da terapia genética 5:59 que já existe 6:02 a principal causa de terapia gênica que 6:05 existe atualmente 6:07 é a produção do adeno 6:09 vírus associado 6:10 em boas condições de fabricação 6:13 a última vez que eu penso em fazer um 6:16 ensaio clínico 6:17 para uma entrega sistêmica de algum gene 6:20 terapia 6:22 foi cerca de um milhão de dólares para produzir 6:26 aav suficiente para tratar um paciente para fazer 6:29 um ensaio clínico em 10 pacientes 6:31 você precisava apenas para iniciar um orçamento de 6:34 10 milhões 6:36 e é claro que até agora eu não fui 6:38 capaz de obter 6:39 orçamento tão grande o único 6:42 pessoas que têm um orçamento tão grande são 6:45 empresas americanas 6:47 que vai gastar uma fortuna fazendo isso 6:50 ensaios clínicos e eles têm milhões 6:51 de dólares 6:52 disponível o problema é realmente que 6:55 depois 6:56 o tratamento foi demonstrado 6:58 eficaz 7:00 o custo do tratamento é de 23 milhões 7:02 dólares por pessoa 7:04 então eu acho que é isso 7:07 o futuro que precisamos para desenvolver gene 7:09 terapia para 7:10 muitos muitos idiotas todas as doenças, mas nós 7:13 também precisa desenvolver 7:14 uma terapia genética barata que você conhece iii 7:17 pense idealmente 7:18 uma terapia genética deve ser em torno de 100 000 7:22 não um milhão de dólares porque a maioria dos 7:25 saúde sistema de saúde pública 7:27 não posso dar ao luxo de fazer isso eu acho que 7:29 é só nos estados unidos 7:31 onde os ricos podem pagar 7:34 Essa 7:35 e os pobres não terão acesso a 7:37 o tratamento 7:40 [Música] 7:42 ainda olhando para baixo para a lista para ver 7:44 se houver alguma outra pergunta 7:49 desculpe-me professor jax uh 7:52 apenas para fazer um pequeno comentário aqui para 7:54 aqueles que não falam 7:55 inglês vou tentar pegar a ideia geral 7:59 a partir de 8:00 as respostas que você acabou de dar e pegue o seu 8:02 Gabriel também 8:03 ah só um segundo 8:10 principalização 8:18 [Música] 8:24 esqueceram 9:20 um 9:49 obrigado pelo seu tempo e se existe 9:52 qualquer pergunta você pode 9:53 continue lendo e respondendo 9:56 bem, se houver outras perguntas, pessoas 10:00 sempre pode me enviar alguns 10:02 e-mails ok 10:05 uh obrigado professor jack inglaterra 10:08 por este encontro maravilhoso obrigado 10:11 Gabrielle 10:12 obrigado barbara dr barbara oliver 10:17 obrigado matthieu tiros e espero que você 10:20 tem outra 10:22 mais um encontro assim 10:25 muito obrigado muito obrigado 10:29 adeus obrigado  

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0:28 bem-vindo obrigado por me receber uh vamos ver se 0:34 podemos começar oi meu nome é gabriel lamot e hoje 0:41 eu estarei discutindo a detecção de cyrus kobe sim, isso é muito melhor é o som 0:47 melhor agora b2 usando tecnologia crispr oh perfeito é o teste que estamos desenvolvendo no laboratório do dr tremblay 0:55 estudos confirmaram que muitos indivíduos infectados com o vírus sars kobe 2 são portadores assintomáticos do vírus 1:02 isso é problemático, pois a pandemia pode estar crescendo sem supervisão adequada, simplesmente concentrando os testes em 1:08 indivíduos com sintomas em oposição a populações inteiras não é suficiente 1:14 para melhor conter o vírus até que uma distribuição em larga escala de uma vacina eficaz esteja em andamento em larga escala e 1:20 teste contínuo é obrigatório o pipeline de diagnóstico atual para 1:26 detectar sars cov2 é um processo de três etapas, o primeiro passo é obter swabs nasofaríngeos de 1:32 pacientes o próximo passo é isolar o rna total das referidas amostras e fornecer o rna necessário para isso 1:40 terceiro passo, que é usar máquinas de videogravador quantitativo em tempo real, o rna é primeiro transcrito inversamente 1:46 em dna e, em seguida, amplificado, um corante é adicionado à reação de amplificação para sinalizar a presença de dna 1:52 fitas após um certo número de ciclos de amplificação, um resultado positivo dará 1:57 um sinal forte o suficiente para que a máquina o sinalize como contendo o vírus original agora esse processo é problemático para um 2:04 algumas razões, a primeira é que as máquinas de PCr em tempo real são extremamente caras 2:10 a maioria pode variar de 15.000 dólares americanos a mais de 90.000 dólares americanos 2:16 dado que é um equipamento bastante especializado e que nem todos os laboratórios de biologia molecular precisam de um 2:22 alguns se dão bem com uma máquina de pcr comum que custa 5000 dólares muito mais razoáveis 2:28 como tal teste generalizado para os coronifiers usando essas máquinas não é ideal 2:33 adquirir o grande número de máquinas necessárias para testes generalizados é uma façanha por si só 2:39 e é provavelmente um dos fatores que contribuem para os longos tempos de espera por resultados 2:45 muitos relatos afirmaram que pode levar de 3 a 24 horas ou mais para obter resultados em uma clínica 2:51 laboratório de diagnóstico aqui no Canadá ontário relata tempos de espera de até quatro dias para obter resultados 2:58 áreas metropolitanas de alta densidade, como Nova York, também estão sujeitas a longas filas para testes e, em seguida, um tempo para 3:05 resultados de cerca de sete dias para algumas clínicas daquela cidade a criação de novos tipos de testes de detecção 3:12 é, portanto, um passo importante para conter a propagação deste vírus, um teste ideal precisa seguir o mundo 3:19 os critérios da organização de saúde para garantir que é o teste precisam ser acessíveis 3:25 para o maior número possível de pessoas em risco de infecção testes que exigem reagentes ou máquinas extremamente caras 3:31 não são ideais o teste também deve ser específico para evitar falsos negativos dessa forma qualquer pessoa 3:37 quem pode potencialmente espalhar o vírus pode ser identificado e colocado em quarentena o teste deve ser sensível 3:43 para que poucas pessoas que não tenham o vírus sejam rotuladas erroneamente como tendo e tratadas inadequadamente 3:48 o teste também deve ser amigável ao usuário, ou seja, deve ser simples de executar e deve ser rápido e robusto, ou seja, 3:55 deve dar um tempo aos resultados que seja rápido o suficiente para aproveitar ao máximo as situações de resultados em que pode levar até sete 4:02 dias para obter resultados estão claramente longe do ideal, pois no momento em que o paciente recebe 4:07 a informação que eles podem ter infectado muitos outros o teste deve ser livre de equipamentos tanto 4:13 como possíveis testes que exigem muitas máquinas raras e caras não são ideais para muitos 4:18 países, finalmente, o teste deve ser entregue a quem precisa 4:24 a descoberta do cast 13 ou c2 c2 foi revolucionária no campo da detecção molecular 4:31 este efetor crispr classe 2 tipo 6 é semelhante à proteína lançada 9 fora de 4:36 qual terminação base e terminação prime foram projetadas esta proteína também é um membro da família crispr 4:43 ao contrário do cas9, no entanto, o cast 13 pode ser programado para direcionar rnas em oposição a dnas 4:49 ao se ligar ao seu crispr rna cas13 é preparado para direcionar sequências de rna extremamente específicas após localizar um alvo 4:57 sequência a proteína cast 13 é ativada, isso faz com que a proteína comece a clivar 5:03 tudo ao seu redor em um evento chamado clivagem colateral ele cliva seu alvo original 5:08 e, em seguida, passa a começar a clivar todos os pesquisadores de rnas ao redor perceberam que isso 5:14 clivagem colateral poderia ser usada para transformar a proteína em um interruptor para um teste de detecção uma vez 5:19 a molécula alvo está presente o interruptor é acionado o cast cas13 ativado e todos os rnas circundantes são degradados por 5:27 marcando certos rnas na solução com uma molécula fluorescente e um supressor 5:32 seria, portanto, possível resolver um sinal que os pesquisadores começaram a desenvolver 5:38 um teste de detecção baseado nesta proteína para vírus, bactérias e doenças humanas, como câncer 5:45 no entanto, eles logo notaram que havia certas limitações para a proteína e que a detecção limitada estava longe de ser sensível 5:51 suficiente para suas necessidades, recentemente, alguns testes foram projetados usando apenas cast 13 5:57 no entanto, esses testes são menos sensíveis e tendem a usar uma proteína cast 13 diferente 6:03 pesquisadores do amplo instituto decidiram complementar a proteína com algumas outras que amplificariam a 6:08 direcione o rna para este fim dr zhang e sua equipe criaram um novo teste chamado de alta sensibilidade específica 6:16 desbloqueio de repórter enzimático ou sherlock para abreviar este teste é baseado 6:21 na transcrição reversa do rna alvo em dna depois o dna é amplificado em um 6:27 temperatura constante usando um processo chamado amplificação da polimerase recombinase 6:32 esta técnica amplifica uma pequena quantidade de dna a uma temperatura constante ao contrário do bcr mais comumente usado 6:40 a incorporação desta etapa também significa que o teste de detecção que se segue pode direcionar o dna desde que a reação rpa 6:47 simplesmente amplifica uma determinada seção de dna usando dois primers, a sequência genética inicial pode 6:53 ser rna ou dna, desde que as enzimas transcriptase reversa estejam presentes para o rna 7:00 as sequências amplificadas são então transcritas usando uma t7 rna polimerase para criar grandes quantidades do alvo 7:07 rna isso permite que o cas13 tenha um pool muito maior de moléculas-alvo 7:12 que pode ativar a enzima uma vez que a enzima está ativa, ela faz o que discutimos antes 7:18 e começa a clivar todos os rnas circundantes, incluindo os rnas repórteres, que emitem o sinal facilmente detectável 7:24 que faz o teste funcionar em sua versão inicial do sherlock test dois repórteres diferentes 7:31 moléculas foram usadas o primeiro usou uma molécula fluorescente, bem como um supressor 7:37 e foi capaz de produzir muita fluorescência após a clivagem do rna o outro 7:44 foi projetado para interagir com alguns anticorpos e quando foi clivado apareceu como um 7:50 segunda banda em uma tira que era bastante semelhante a um teste de gravidez 7:55 embora esse teste tenha sido bom em muitos aspectos, ele teve algumas desvantagens no início da pandemia, tentamos replicá-lo e 8:01 imediatamente teve alguns problemas, o maior problema de longe foi que alguns dos materiais necessários para o teste 8:07 para trabalhar só estavam disponíveis em oferta extremamente limitada os kits necessários para realizar rpa 8:12 reações, por exemplo, levaram aproximadamente dois meses para chegar e mesmo assim só recebemos o suficiente 8:18 materiais para realizar 200 testes, isso claramente não seria suficiente para produzir testes suficientes no 8:24 futuro, além disso, o repórter que usou uma tira estilo gravidez foi notável e parecia ser muito 8:31 útil no entanto, uma vez que era muito difícil adquirir quantidades insuficientes 8:36 decidimos não usá-lo e, em vez disso, concentrar nossos esforços no uso do repórter de estilo fluorescente rna desde a versão original 8:44 do teste não pôde ser usado por nós da maneira que se pretendia, decidimos redesenhá-lo 8:51 ao redesenhar o teste tínhamos várias opções e caminhos que podíamos seguir sabíamos que queríamos continuar usando 8:57 cast 13 porque tínhamos um grande suprimento dessa enzima devido a uma colaboração contínua com o dr 9:02 alain ghani também sabíamos que queríamos a todo custo manter a natureza isotérmica do 9:08 neste teste uma das maiores vantagens do sherlock foi que ele não exigia grandes quantidades de equipamentos caros 9:14 simplesmente usando um bloco de aquecimento ou algo do tipo era possível obter uma leitura visual 9:20 decidimos, portanto, empregar amplificação isotérmica mediada por loop ou lâmpada para encurtar essa amplificação 9:27 estratégia foi bastante bem documentada e fácil de executar com base no uso de seis primers 9:33 técnica poderia amplificar rapidamente grandes quantidades de DNA alvo, ao contrário de rpa e pcr, no entanto 9:39 lâmpada não cria amplicons idênticos de tamanho discreto, em vez disso, os seis primers podem interagir para 9:46 criar moléculas muito maiores de uma sequência de repetição inicialmente era um pouco difícil 9:52 incorpore essa estratégia de amplificação isotérmica em nosso teste, pois você pode se lembrar da etapa seguinte 9:58 rpa no teste sherlock original foi aquele que produziu muitos e muitos rna alvo 10:03 essa produção de rna alvo só foi possível porque a etapa rpa adicionou uma tag que deixou o rna t7 10:10 polimerase se liga ao dna e começa a transcrevê-lo, no entanto, ninguém aparentemente nunca fez 10:16 que com lâmpada e como essa nova técnica usou seis primers, dois dos quais se enrolaram para criar 10:22 halteres estranhos como estruturas de estrutura, era difícil descobrir exatamente onde incorporar essa tag 10:29 depois de um tempo, decidimos incluir a tag bem no meio de um de nossos primers de loop, isso tem sido consistentemente 10:35 dado resultados muito fortes, fomos capazes de adaptar o sherlock original 10:41 teste com uma nova estratégia de amplificação enquanto ainda se beneficia da especificidade e sinalização do cast 13 10:48 o novo teste está, portanto, usando rt lamp em vez de rt rpa, é claro 10:54 devemos nos interessar em direcionar o DNA no futuro para certos tipos de vírus ou 11:00 certas bactérias este teste seria prontamente aplicável a isso também decidimos usar um fluorescente 11:07 repórter rna em vez do estilo de gravidez que falamos anteriormente porque parecia ser o mais prontamente 11:13 material disponível, uma vez que não é necessário nenhum maquinário particularmente avançado para fazê-lo funcionar 11:18 ficamos felizes em escolher este 11:24 agora que você sabe como o teste funciona do ponto de vista teórico, vamos discuti-lo de um ponto de vista mais prático por enquanto 11:31 o teste requer que comecemos com rna que foi extraído de um vírus usando um kit comercialmente disponível 11:37 microlitro desta solução é transferido para o tubo contendo a reação da lâmpada rt 11:42 idealmente, no futuro, gostaríamos de modificar o teste para que seja possível adicionar diretamente a saliva de um paciente 11:48 a ele e continuar a partir daí, o que reduziria visivelmente o trabalho necessário para obter cada leitura 11:54 reduzir o custo geral e tornar muito mais rápido os resultados 11:59 depois de transferir um microlitro do extrato de rna para o primeiro tubo, o tubo deve ser incubado a 65 12:05 graus Celsius por 30 minutos depois que um microlitro é transferido do primeiro tubo 12:11 no segundo que contém o t7 e lance a solução 13 depois de bater no tubo algumas vezes para 12:18 misture e microcentrifugue por alguns segundos tudo o que você precisa fazer é incubar esse tubo a 37 graus Celsius 12:25 por 30 minutos nesse ponto todas as reações são feitas e que os resultados estão prontos para serem 12:31 ler expondo os tubos a um comprimento de onda de aproximadamente 490 nanômetros 12:36 é possível detectar facilmente quais amostras contêm cyrus cov2 aquelas que irão fluorescer um verde brilhante 12:43 aqueles que não continham nenhum dos espécimes virais de interesse serão completamente incolores e indistinguíveis de um tubo cheio 12:50 com um pouco de água eu vou te mostrar que mais tarde agora vale a pena notar que as sequências de dna e rna 12:57 que usamos nesta primeira versão do nosso teste foram todos publicados anteriormente por diferentes grupos 13:03 como tal, não acreditamos que resultem em um sinal positivo quando na presença de um rna relevante 13:10 isso é particularmente importante porque sua saliva está cheia de rna o processo de extração do vírus 13:16 de fato resulta na captura de rnas virais, mas tende a haver muito mais 13:22 rnas humanos e bacterianos, além de outros coronavírus que são 13:27 muito menos perigosos são bastante comuns na população humana se nossos testes deram sinais positivos toda vez que alguém entrou 13:34 com um resfriado comum, não seria muito eficaz, pois nos baseamos em 13:39 modelos descritos anteriormente para tentar evitar isso o máximo possível 13:45 ao projetar este teste, tentamos garantir que ele não dependesse excessivamente de máquinas complicadas 13:50 queríamos que todo o teste fosse fácil de realizar usando apenas alguns aparelhos comuns de laboratório 13:56 como resultado, com esta iteração atual do teste, tudo o que precisamos é de uma máquina que possa aquecer 14:02 tubos estilo pcr a 65 graus celsius e um que pode aquecer 14:07 os tubos pcr a 37 graus celsius também precisamos de dois p2 ou p10 14:14 pipetas por motivos que abordaremos mais tarde, juntamente com suas pontas de peptídeos associadas 14:20 uma pequena microcentrífuga capaz de receber tubos de PCr também é necessária apenas para garantir que a reação 14:26 misturas não tocam no topo do tubo quando você os abre e potencialmente contaminam 14:31 todos os tubos circundantes, finalmente, é necessária uma máquina capaz de emitir comprimentos de onda ultravioleta 14:38 nesta imagem você verá a máquina que tenho usado é mais comumente usada para visualizar géis em uma biologia molecular 14:44 lab, mas faz um trabalho muito bom ao visualizar nossas amostras positivas em nosso teste para as duas incubações 14:52 períodos várias opções diferentes estão disponíveis eu tenho usado um termociclador antigo hoje 14:57 como eu acho que ele faz um bom trabalho de aquecimento uniforme dos meus tubos, vale a pena notar aqui que isso significa 15:03 que mesmo termocicladores antigos e degradados que não fazem mais um bom trabalho de ciclismo entre temperaturas 15:09 pode ser prontamente usado neste teste, ao contrário do padrão ouro rtq pcr atual que requer 15:16 termocicladores especializados em tempo real aqui qualquer máquina antiga pode ser usada 15:22 também é possível usar outros aparelhos comuns de laboratório, como aquecedores de bloco que têm um 15:27 adaptador para tubos pcr por favor note que nesta foto o aquecedor do bloco tem um adaptador para 1,5 15:34 tubos de microcentrífuga milimétricos para que o verdadeiro adaptador pareça um pouco diferente 15:39 também usei incubadoras com grande sucesso, mesmo incubadoras bacterianas que operam a 37 graus constantes 15:46 celsius pode atender perfeitamente às necessidades deste teste, desde que os tubos sejam prontamente expostos 15:51 à temperatura ambiente, os sinais positivos não devem ter dificuldade em resolver 15:56 observe, no entanto, que ao usar incubadoras, é melhor ter os tubos expostos ao ar 16:02 assim eles não perdem tempo enquanto o rack começa a esquentar lentamente 16:07 os banhos de água são uma opção final que pode escolher pessoalmente, tendo a tendência de evitar esta opção 16:13 porque acho que o risco de contaminação cruzada entre amostras é muito maior e, portanto, não ideal 16:19 no entanto, tentei realizar reações de lâmpada rt com este sistema e desde que você esteja 16:24 cuidado é muito possível fazê-lo 16:30 uma vez que as reações tenham sido concluídas, é possível usar várias máquinas diferentes para visualizar os tubos dependendo da 16:36 materiais que seu laboratório tem pessoalmente minha máquina de escolha é um emissor de uv de gel 16:42 essas máquinas que são mais comumente usadas para visualizar géis de agarose fazem um trabalho muito bom em mostrar com segurança 16:48 quais tubos são fluorescentes e quais não são luzes negras também podem ser usadas 16:53 para este teste, no entanto, achei-os um pouco menos desejáveis, pois o repórter rna absorve melhor 16:59 comprimentos de onda de 490 nanômetros descobri que as luzes negras que produzem comprimentos de onda de 390 nanômetros 17:06 para ser menos favorável para este teste para eles funcionarem é melhor visualizar os tubos em um quarto escuro 17:13 em ambos os casos a máquina deve realmente ser colocada em uma sala mais escura longe da luz excessiva um pouco 17:19 a luz de fundo parece ter menos efeito no caso da luz uv em gel, no entanto 17:25 esta foto vista à esquerda foi tirada usando um iphone genérico quando os tubos foram colocados no gel uv 17:31 acender as luzes da sala foram apenas parcialmente desligadas, resultando em muita iluminação ambiente 17:37 mesmo que não houvesse luzes apontadas diretamente para a máquina, dada a radiação forte e uniforme que os tubos 17:44 recebido nesta máquina é fácil determinar quais amostras foram positivas e quais foram negativas 17:50 no caso da luz negra à direita fica claro quais amostras são positivas e quais são negativas 17:55 claro, no entanto, a fluorescência não é uniforme e é um pouco mais difícil de detectar 18:01 a olho nu, neste caso, a câmera do iphone tirou uma foto muito boa 18:06 e tornou mais fácil visualizar os tubos em geral, agora existem vários importantes 18:11 considerações a serem feitas ao usar este teste para que ele funcione corretamente e não dê falsos positivos ou falsos 18:17 negativos, é importante primeiro designar estações de trabalho adequadas para cada seção do teste. 18:24 necessário seguir os tempos de reação pré-determinados sem variar, caso contrário os resultados podem começar a 18:30 diferem ligeiramente, finalmente, aqueles que manuseiam o teste devem ter cuidado para não contaminar nenhum dos 18:36 tubos com rnases a primeira consideração para separar 18:41 áreas de trabalho é extremamente importante porque o cordeiro é excessivamente sensível esta técnica é conhecida por produzir lotes 18:48 e muito DNA alvo concentrado nós, assim como outros, notamos que 18:54 quando abrimos tubos que completaram a amplificação da lâmpada na mesma área que originalmente usamos 18:59 para preparar a reação é possível contaminar a área de trabalho com aerossóis contendo o 19:04 produto se você continuar a configurar as reações da lâmpada nessas áreas depois, corre o risco de 19:11 contaminando seus novos tubos com amplicons das reações anteriores, tocando sua mesa ou 19:16 várias outras superfícies contaminadas com suas luvas, você corre o risco de semear artificialmente sua reação 19:22 misturas que contêm rna do paciente sem sarisco v2 e, portanto, produzem resultados positivos 19:29 quando realmente não deveria haver nenhuma separando as áreas nas quais você configura as reações da lâmpada 19:34 e aqueles em que você usa as sequências amplificadas você corre menos risco de isso acontecer é 19:40 também é necessário ter pipetas designadas para jalecos e outros materiais para cada estação de trabalho 19:47 se aqueles na estação de trabalho 2 forem contaminados, você não deseja que isso volte para a estação de trabalho 1. 19:53 observe que isso é muito menos rigoroso ao trazer materiais da estação de trabalho 1 para a estação de trabalho 2. 19:59 uma vez que é a reacção da lâmpada rt que corre o maior risco de contaminação trazer material por exemplo luvas 20:06 dessa estação para a próxima não deve ser um problema, desde que as luvas ainda estejam 20:12 relativamente limpo, observe que esta situação de contaminação por aerossol 20:18 é de muito menos importância durante a segunda etapa do teste, pois discutimos anteriormente o elenco 13 20:24 proteína que estamos usando requer uma quantidade relativamente grande de rna para ser funcional 20:30 no momento, não estamos preocupados com a contaminação por aerossol da lâmpada 20:35 pode produzir falsos positivos de nossas reações do elenco 13, pois ainda temos que ver uma única situação 20:41 onde isso aconteceu, a segunda consideração digna de nota é que 20:47 o tempo de reação deve ser seguido uma pequena discrepância pode ser tolerada que seja um minuto a mais ou a menos não 20:54 realmente parecem ter um grande impacto no teste, no entanto, mais do que isso pode começar a se tornar problemático 21:01 no caso das equipes externas de reação à lâmpada rt, assim como nós vimos que dobrando a reação 21:07 tempo para a lâmpada podem surgir falsos positivos como você pode ver aqui em ambas as fotos 21:13 uma reação bem-sucedida da lâmpada também pode ser visualizada em um gel de agarose, as reações bem-sucedidas são 21:19 caracterizada pela presença de várias bandas grandes de tamanhos variados, no entanto, quando a lâmpada 21:25 as reações continuam por muito tempo é possível começar a amplificar amostras sem nada nelas 21:30 por exemplo à esquerda você verá um gel que foi retirado de um artigo no qual em 30 minutos os poços 21:37 contendo reações com 10 cópias do alvo são RNA viral e nenhuma cópia do 21:42 o rna viral alvo não tinha bandas no caso do gel à direita um gel que fiz três dos poços 21:50 continha reações que não tinham rna alvo para falar apenas do fragmento n bem contido 21:56 rna alvo em 30 minutos esses controles negativos não demonstraram qualquer amplificação 22:02 como esperávamos, no entanto, em 60 minutos, tanto o gel publicado quanto o meu começaram 22:08 para dar produtos amplificados em seu caso as cópias de dez e zero começaram a ser amplificadas 22:15 e no meu caso uma das minhas amostras negativas começou a ser amplificada eu realizei 22:22 vários experimentos até agora com tempos de incubação de 30 minutos e até agora nunca obtiveram falsos positivos 22:29 para não dizer que é totalmente impossível simplesmente que é muito improvável como um 22:35 nota lateral este é um bom momento para mencionar que trocar as luvas com frequência ao realizar a primeira reação 22:41 é uma boa maneira de evitar esse tipo de falsos positivos improváveis ​​após o uso prolongado, as luvas podem se tornar 22:47 contaminados com pequenas quantidades de RNA viral e que poderiam levar a falsos positivos mesmo se estivéssemos apenas incubando 22:54 em 30 minutos a consideração final a ser observada 22:59 é a presença de rnases para aqueles que podem não estar familiarizados com rnases são enzimas que clivam 23:05 todos os rnas que encontrarem ambos os passos para este teste são sensíveis a rnases 23:11 a lâmpada artística inicial começa sua amplificação a partir de rna, de modo que a presença de rnases pode ser muito 23:17 prejudicial e, portanto, levar a falsos negativos a segunda etapa do teste o t7 e o elenco de 13 etapas usam 23:25 um repórter de rna para sinalizar tubos positivos se enquanto você estiver usando os testes você começar a introduzir rnases 23:31 então você corre o risco de obter falsos positivos rnases são extremamente difíceis de remover 23:37 uma vez que eles são introduzidos em um sistema, então o melhor meio de proteger seu teste é usando a prevenção 23:43 uma vez que as suas mãos produzem muitos rnases é obrigatório o uso de luvas sempre ao trabalhar com o teste 23:49 ao fazer isso, você evitará que as rnases naturais do seu corpo degradem o cov2 da estrela inicial 23:54 rna e proteger o repórter fluorescente no final as luvas também devem ser trocadas sempre que 24:00 eles entram em contato com o cabelo da pele ou outros objetos frequentemente manipulados 24:06 como maçanetas e dispositivos pessoais o uso de rnas e dnase free 24:12 pipetas filtradas também é importante para este teste usando esses tipos de pontas especializadas 24:19 você pode ter certeza de que quaisquer possíveis contaminações que você possa ter em suas pipetas não tenham chance 24:24 contaminar seu teste em áreas onde o risco de contaminação por rnas é bastante alto 24:30 pode valer a pena tratar todas as superfícies ou ferramentas com uma solução de remoção de rnas 24:36 tipos de soluções podem degradar rnases que poderiam grudar em suas luvas e contaminar suas amostras 24:42 por favor, note que eu não tive que usar a solução com muita frequência, desde que você mantenha um 24:48 horário de trabalho você deve estar bem o segundo componente para o teste 24:54 o que contém t7 e cast 13 também é projetado para tolerar um 24:59 certo nível de rnases contaminantes há um inibidor de rnas adicionado à mistura de reação 25:06 para evitar a degradação do repórter no caso do sars kobe 2 rna original 25:11 não estava completamente limpo ou no caso de ocorrerem contaminações enquanto você preparava os testes 25:18 que disse que a presença de rnases excessivos ainda pode ativar totalmente o teste visto 25:24 aqui à direita um microlitro de rnase a muito concentrada é capaz de fazer com que o tubo de ensaio 25:30 tornar-se fluorescente, portanto, é importante levar a 25:40 requerido 25:54 cabrillo 26:02 teste que pode ser amplamente distribuído e, ao mesmo tempo, atender a esse limite de detecção, é totalmente funcional para conter a 26:10 propagação desta pandemia enquanto rt-qpcr é muito mais sensível 26:15 do que isso, sua detecção limitada aprimorada pode não ser necessariamente tão benéfica 26:20 uma vez que esta técnica pode pegar rnas liberados por células infectadas e mortas após a infecção 26:26 seguir seu curso, essa forma de triagem pode fazer com que indivíduos nominalmente sars kovi sejam positivos, mas não sejam 26:34 realmente infeccioso para ser isolado desnecessariamente como você pode ver aqui à nossa esquerda 26:41 teste de detecção é capaz de detectar amostras que possuem 100 cópias por microlitro como foi estipulado pelo modelo mais 26:49 comparação recente entre os diferentes primers que usamos para a lâmpada demonstrou que uma versão do nosso 26:55 teste pode detectar amostras contendo apenas 80 cópias por microlitro, enquanto o outro só pode detectar amostras 27:01 contendo 1 000. no futuro, provavelmente concentraremos nossos esforços no primeiro conjunto de cartilhas para garantir que 27:08 atendemos o limite de detecção que foi estipulado pelo modelo 27:13 como nota final, estamos felizes em informar que nosso teste funciona não apenas em fragmentos do cyrus 27:19 genoma cov2 também funciona quando exposto ao perfil completo de rna do vírus 27:25 inicialmente começamos o desenvolvimento do nosso teste usando fragmentos dos genes do vírus que tínhamos 27:31 nos transcrevemos no laboratório recentemente, usamos o teste em 27:36 vírus sars cov2 e obtivemos os resultados esperados, como você pode ver à esquerda 27:42 a primeira seção da reação a reação da lâmpada rt funciona exatamente como esperado no rna viral 27:48 os poços superiores esquerdos que foram executados no gel de agarose demonstram claramente uma forte amplificação abaixo deles três 27:56 reações foram realizadas com células que não haviam sido cultivadas com o vírus os rnas virais foram criados pela primeira 28:02 isolando os vírus de um paciente, esses vírus foram então cultivados em células viroe6 28:08 e após alguns dias o meio de cultura foi tratado para extrair todo e qualquer rna que estivesse presente no 28:15 os vírus foram, portanto, destruídos e seu rna foi obtido quando os amplicons de laboratório que haviam 28:21 amplificado o vírus real foram transferidos para a segunda fase do teste eles deram o esperado 28:26 fortes sinais fluorescentes no momento o que resta a ser feito é usar nossos testes em amostras 28:33 que foram confirmados positivos ou negativos por rtq pcr o padrão ouro atual em sarsko v2 28:40 detecção e ver como nosso teste se compara isso nos dará uma indicação melhor 28:45 do que nossos testes de sensibilidade e especificidade são apenas para encerrar 28:52 gostaria de agradecer ao dr gary cobinger dr ellen gianni e dr ghibwave por terem ajudado a 28:58 fornecer financiamento ou materiais para este projeto eu também gostaria de agradecer ao dr tremblay e a todos em sua equipe 29:04 por ter ajudado a fornecer alguns insights enquanto eu redesenhava este teste, finalmente gostaria de agradecer ao dr marcelo por 29:12 tendo ajudado a organizar todo este encontro e o instituto canadense de pesquisa em saúde 29:17 e os frqs por terem me ajudado a me financiar enquanto eu seguia este projeto 29:27 ok então essa foi minha apresentação uh sim 29:34 obrigado gabriel uh eu vou tomar o tempo apenas para fazer um uh para resumir o melhor que posso aqui 29:41 para os que não falam inglês muito obrigado pela apresentação obrigado ok